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ELISA在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

   獸藥殘留分析技術(shù)是復(fù)雜混合物中的痕量分析技術(shù)，現(xiàn)代方法通常包括樣品的前處理（提取、凈化、濃縮和衍生化）和測(cè)定兩部分。zui初，殘留分析技術(shù)極限于化學(xué)分析法、比色法和微生物法。化學(xué)分析法和比色法缺乏專一性和敏感性，而微生物法雖然普通適用于抗菌藥物的殘留測(cè)定，但不易篩選到特別敏感的菌株，方法常受到其他抗菌藥物的影響。薄層色譜（TLC）操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，但乃需要復(fù)雜的樣品前處理，靈敏度不高。20世紀(jì)60年代后的GC 和七八十年代后的質(zhì)譜（MS）、HPLC以及GC-MS、LC-MS等聯(lián)用技術(shù)的飛速發(fā)展大大地提高了分析的靈敏度和分辨率，拓寬了殘留分析范圍。HPLC和GC等方法較之微生物法有高度的靈敏度和特異性，但設(shè)備昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員也有較高的要求，分析費(fèi)時(shí)而不易推廣。同時(shí)它還需要復(fù)雜煩瑣的樣品前處理且不能同時(shí)篩選大量的樣品，這對(duì)藥物殘留的及時(shí)監(jiān)控?zé)o疑是不合適的。20世紀(jì)90年代后，免疫檢測(cè)技術(shù)飛速發(fā)展，大大推動(dòng)了獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的進(jìn)程，一系列免疫檢測(cè)試劑盒的生產(chǎn)與應(yīng)用加快了獸藥殘留分析的標(biāo)準(zhǔn)化。目前普遍應(yīng)用于獸藥殘留分析的是酶免疫檢測(cè)法，其研究過(guò)程一般包括人工抗原的合成、抗體的制備以及檢測(cè)方法的建立等步驟。但絕大多數(shù)藥物是小分子物質(zhì)，分子量小于1KDa，沒(méi)有免疫原性，必須把它交聯(lián)到大分子蛋白質(zhì)上制備人工抗原來(lái)獲得免疫原性。因此獸藥的免疫檢測(cè)有其自身的特點(diǎn)。單克隆抗體在靈敏度和交叉反應(yīng)方面都優(yōu)于多克隆抗體，且具有均一性、專一性和*性等特點(diǎn)，有利于標(biāo)準(zhǔn)化。

     內(nèi)酰胺類

Rose等用頭孢噻呋的水解產(chǎn)物去呋喃羰基頭孢噻呋作為半抗原，將其原位交聯(lián)到載體蛋白BSA和KLH上制備了兩種人工抗原，免疫BALB/c小鼠后zui終篩選出兩株單克隆抗體，cef-68和cef-116,并以之建立了檢測(cè)頭孢噻呋的Ci-ELISA方法，cef-68和cef-116的IC50分別為32ug/kg和0.33ug/kg,，其檢測(cè)限分別為32ug/kg和0.33ug/kg。單克隆抗體對(duì)頭孢噻呋有較高的選擇性，交叉反應(yīng)的數(shù)據(jù)表明只有少數(shù)頭孢菌素與之有交叉反應(yīng)，而青霉素則與之沒(méi)有交叉反應(yīng)。

     氟喹諾酮類

     Holtzapple等先將載體蛋白BSA、卵清蛋白OVA用過(guò)量的乙二胺處理后碳二亞胺法合成了cOVA-Sara和cBSA-Sara兩種沙丁沙星人工抗原。以cBSA-Sara免疫BALB/c小鼠，

用cOVA-Sara作包被原篩選出了6株單克隆抗體，并以之建立了檢測(cè)沙丁沙星的Ci-ELISA方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50范圍為7.3~48.3ug/kg,批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差11.0%（n=3）,批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差10.8%（n=3）,檢測(cè)限為2 ug/kg。組織樣品在10 ug/kg 、50 ug/kg、100 ug/kg的添加水平下回收率分別為132%、78%和81%。交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)表明單抗對(duì)沙丁沙星有很高的選擇性。

      Duan等制備了環(huán)丙沙星多克隆抗體，并建立了檢測(cè)環(huán)丙沙星殘留的Ci-ELISA方法，檢測(cè)限為0.32ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線0.32ng/mL~5000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，批內(nèi)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.81%和11.23%。環(huán)丙沙星在豬肉、雞肉及牛乳中的回收率分別為75.58%、81.2%和84.5%。抗血清與思諾沙星的交叉反應(yīng)率為69.8%，與金霉素、慶大霉素、青霉素、新霉素、喹乙醇和磺胺等無(wú)交叉反應(yīng)。蔡勤仁等制備了恩諾沙星單克隆抗體，Ci-ELISA的zui低檢測(cè)限為0.13ng/mL。

     磺胺類

      李喜旺等制備了6種模擬磺胺類藥物母核結(jié)構(gòu)的人工抗原和3種多克隆抗體，并對(duì)抗體的選擇性與親和性，免疫原與靶物質(zhì)的免疫相關(guān)性和免疫反應(yīng)條件進(jìn)行了探討。部分抗體對(duì)參試的9種磺胺類藥物顯示了高度的選擇性和親和性，其中7種藥物Ci-ELISA抑制曲線，檢測(cè)限低于0.01 ug/mL,并在PH=4.4~5.4的介質(zhì)中親和性zui強(qiáng)。Sheth等制備了多種模擬磺胺類藥物母核結(jié)構(gòu)的人工抗原和多克隆抗體，并以建立了檢測(cè)磺胺類藥物的Ci-ELISA方法。吳定等以BSA為載體合成兩種不同摩爾比值（1：13和1:42）磺胺甲基嘧啶人工抗原并比較其免疫原性。免疫家兔后獲得抗磺胺甲基嘧啶（SMD）多克隆抗體，并以之建立了乳中磺胺甲基嘧啶殘留的Ci-ELISA方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線的工作濃度為5~20ng/Ml,檢測(cè)限為2.4ng/ML回收率88%~118%。抗血清與磺胺二甲基嘧啶和磺胺噻唑交叉反應(yīng)率分別為6.0%和0.84%，而與其他磺胺類藥物無(wú)交叉反應(yīng)。研究結(jié)果還表明半抗原與載體蛋白的結(jié)合比在1:10~1:25為宜。劉智宏等用戊二醛法合成了SQ-BSA人工抗原并用其免疫家兔制備了SQ多克隆抗體，并以之建立了Ci-ELISA方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，檢測(cè)限為100uL/L,回收率為93.7%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差6.4%。抗血清對(duì)SQ有很高的選擇性，在12種磺胺類和非磺胺類藥物中，zui大交叉反應(yīng)率僅為0.1%。

     生長(zhǎng)激素類

     陳繼明等分別以偶氮方法和碳二亞胺法將B2受體激動(dòng)劑克侖特羅（CL）和塞曼特羅（CIM）交聯(lián)到載體蛋白BSA和OVA上制成人工抗原，免疫家兔后分別制備了兔抗CL和CIM抗血清，并在此基礎(chǔ)上建立了CL和CIM殘留的免疫檢測(cè)方法。兩種抗血清的工作濃度分別為1:1.0X10（3）。CL和CIM的檢測(cè)范圍分別為1.9-15.6ng/mL和0.477-1.85ng/mL。何方洋等用重氮化法制備了克侖特羅人工抗原并獲得了一株穩(wěn)定分泌抗克侖特羅單克隆抗體。Shelver等制備了萊克多巴胺單克隆抗體。Elliott等在山羊體內(nèi)獲取了萊克多巴胺多抗，并建立了分析牛尿液樣品中萊克多巴胺殘留的ELISA方法，該研究表明ELISA方法與LC-MS方法的相關(guān)性很好。

       聚醚類離子載體抗球蟲藥

      Muloon等制備了鹽霉素人工抗原SAL-BSA，并以之免疫BALB/c小鼠，篩選出16株單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)鹽霉素的Ci-ELISA方法。單抗對(duì)鹽霉素有很高的選擇性，能識(shí)別甲基鹽霉素而與拉沙里菌素和莫能菌素沒(méi)有交叉反應(yīng)。該研究還比較了HPLC和ELISA兩種方法，結(jié)果表明兩種方法有很好的相關(guān)性（P＜0.001），但ELISA方法更靈敏，其檢測(cè)限（50ug/kg）較HPLC（100ug/kg）低。Mount等建立了莫能菌素的免疫檢測(cè)方法，檢測(cè)限為2ng/ML。沈建忠等用混合酸酐法和活性酯法合成了5個(gè)馬杜霉素人工抗原，以M-KLH免疫家兔制備了兔抗馬杜霉素抗血清，抗血清工作濃度為1:1.6X10（3）-1:2.56X10（4）,并在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)馬杜霉素的Ci-ELISA方法，用M-C6-OVA作包被原，馬杜霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50值為30.1 -32.3ng/ML，斜率為2.20-2.55（介質(zhì)為PBS-10%甲醇），交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)表明抗體對(duì)馬杜霉素的特征結(jié)構(gòu)具有較高的選擇性。

      抗蠕蟲藥

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      Brandon等制備了苯并咪唑株單克隆抗體，建立了檢測(cè)苯并咪唑類抗蠕蟲藥的Ci-ELISA 方法。該方法可檢測(cè)出1-8ug/kg濃度范圍的苯并咪唑類抗蠕蟲藥 及其代謝產(chǎn)物和甲基苯并咪唑的殘留。且該方法與HPLC方法在檢測(cè)用芬苯噠唑處理的奶牛肝組織殘留時(shí)有很好的相關(guān)性。當(dāng)在牛肝臟樣品中添加等量的苯并咪唑類藥物、亞砜和砜等代謝產(chǎn)物時(shí)，阿苯達(dá)唑和芬苯噠唑的檢測(cè)限分別為58 ug/kg和120 ug/kg 。單抗對(duì)苯并咪唑抗蠕蟲藥有很高的選擇性。Holtzapple等用碳二亞胺法，戊二醛修飾載體法和疏基修飾載體法合成了多個(gè)潮霉素B人工抗原，免疫BALB/C小鼠zui終篩選出7株抗潮霉素B單克隆抗體，并建立了檢測(cè)潮霉素B的Ci-ELISA方法。平均批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差7.8%（n=3）,批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差7.0%（n=3）,zui低檢測(cè)限為0.25mg/kg。組織樣本在1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg的添加水平，回收率分別為83%、82%和91%。單抗對(duì)潮霉素B有很高的選擇性，與結(jié)構(gòu)相似的氨基糖苷沒(méi)有交叉反應(yīng)。Bushway等制備了噻苯達(dá)唑多克隆抗體，并建立了檢測(cè)噻苯達(dá)唑Ci-ELISA方法，整個(gè)分析費(fèi)時(shí)35min（包括樣本準(zhǔn)備），能同時(shí)分析8個(gè)樣品，檢測(cè)限為9ug/kg,批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差5.0%-9.6%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.4%-15%。在50-5.0X10（4） ug/kg添加水平下平均回收率為116%。

     阿維菌素類

李俊鎖等制備了阿維菌素（AVM）人工抗原。研究了牛組織（血漿、肌肉和肝）中阿維菌素殘留的ELISA  反應(yīng)條件和樣本前處理方法，并對(duì)添加樣本進(jìn)行了測(cè)定。AVM標(biāo)準(zhǔn)液的IC50為1.8-4.0ng/mL，檢測(cè)限為0.02-0.2 ng/mL樣本經(jīng)甲醇一次提取和稀釋后直接進(jìn)行檢測(cè)，各樣本中AVM的IC50為3.6-30.2 ng/mL，樣本檢測(cè)限為0.1-0.6 ug/kg.。在6.0-60.0 ug/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為87.9%-108.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%-16.9%。Schmidt等用伊維菌素和阿巴美丁（Abamectin）的衍生物4〞-0-（單）琥珀酸鹽碳二亞胺法制備了多種伊維菌素人工抗原篩選到C4D6等5株單克隆抗體。C4D6對(duì)伊維菌素和Abamectin的檢測(cè)限分別為0.5ug/kg和1ug/kg，標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50分別為3 ug/kg和7ug/kg.。

其他

覃雅麗等制備了氯霉素單克隆抗體，Ci-ELISA的zui低檢測(cè)限為0.1 ng/mL.Stanker等制備了呋喃苯胺酸（利尿藥）單克隆抗體，并建立了檢測(cè)乳中呋喃苯胺酸的Ci-ELISA方法，檢測(cè)限為2 ug/kg.。Abad和Montoya用碳二亞胺法合成了兩種卡巴立（殺蟲藥）人工抗原，免疫BALA/c小鼠后獲得了抗卡巴立單克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)卡巴立的Ci-ELISA方法。Tanaka等制備了大觀霉素多克隆抗體，Ci-ELISA方法的檢測(cè)限為2 ng/mL.

獸藥殘留的免疫檢測(cè)技術(shù)經(jīng)過(guò)近20年的發(fā)展，已經(jīng)取得了可喜的進(jìn)步，但也存在很多不足。總體說(shuō)來(lái)，國(guó)外的獸藥殘留檢測(cè)無(wú)論是常規(guī)技術(shù)還是免疫技術(shù)的發(fā)展都滯后于農(nóng)藥和食品的殘留分析，而國(guó)內(nèi)這些都起步較晚，僅僅是初具規(guī)模，還沒(méi)有規(guī)范化和系統(tǒng)化。絕大多數(shù)獸藥殘留的免疫檢測(cè)方法都沒(méi)有建立。這既有國(guó)家對(duì)此的認(rèn)識(shí)不足，投資了度不夠等主觀原因，也受到其本身的客觀原因所限制。如藥物的人工抗原較難合成，且免疫檢測(cè)技術(shù)雖然有取樣量少、前處理簡(jiǎn)單、容量大、儀器化程度低、分析成本低、效率高、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，但是所提供的待測(cè)物組成或結(jié)構(gòu)方面的信息太少，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。未來(lái)獸藥殘留免疫檢測(cè)發(fā)展的主要趨勢(shì)在以下幾個(gè)方面。（1）集中人力物力制訂一系列的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范獸藥殘留免疫檢測(cè)的方法、步驟、試劑等和培訓(xùn)專業(yè)人員。（2）免疫檢測(cè)與其他常規(guī)方法的聯(lián)合可使殘留分析融免疫分析的高選擇性和理化分析的快速、靈敏性于一體，避免了單純免疫檢測(cè)樣本時(shí)信息太少，定量準(zhǔn)確性不足，或理化分析方法選擇性的弊端，使分析過(guò)程簡(jiǎn)化，分析質(zhì)量得到改善。如先用免疫檢測(cè)對(duì)大批量樣品進(jìn)行篩選再用其他常規(guī)方法確證，或利用抗血清制備的免疫柱（IAC）先將樣品凈化再用常規(guī)方法分析等。（3）免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展也將帶動(dòng)要理研究的發(fā)展，如藥物單抗與基因重組技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用可以反過(guò)來(lái)研究藥物的耐藥機(jī)制，有利于新藥的開發(fā)。

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ELISA在捕食作用研究中的應(yīng)用

長(zhǎng)期以來(lái)，捕食者和獵物之間的相互關(guān)系問(wèn)題一直是生態(tài)學(xué)研究的中心課題之一。昆蟲學(xué)家采用了許多不同的方法來(lái)研究這種關(guān)系，希望能正確評(píng)價(jià)捕食性天敵對(duì)目標(biāo)害蟲的控制作用。在諸多的方法，以血清學(xué)方法zui能獲得捕食作用的直接證據(jù)。血清學(xué)方法的理論依據(jù)在于：天敵消化道內(nèi)存在可與抗體反應(yīng)的獵物蛋白。

利用血清學(xué)試驗(yàn)來(lái)分析捕食者消化道內(nèi)含物的歷史已有40年。zui先采用的是沉淀試驗(yàn)、雙向擴(kuò)散法、單項(xiàng)擴(kuò)散法、對(duì)流免疫電泳、交叉免疫電泳等。沉淀試驗(yàn)既不敏感也不專一，由于其所需的設(shè)備簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、易于解釋試驗(yàn)結(jié)果，因此有不少人采用。隨著免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，許多新的技術(shù)不斷被采用，并朝高靈敏度和特異性的方向發(fā)展。在過(guò)去的十多年里，人們相繼引用了間接（被動(dòng)）凝聚試驗(yàn)、放射免疫試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。前兩個(gè)試驗(yàn)因其過(guò)于復(fù)雜而未被廣泛采用，且放射免疫試驗(yàn)費(fèi)用高也不安全。

zui早將ELISA引入捕食作用研究的是Fichter和Stephen。此后，Ragsdale等應(yīng)用ELISA研究了大豆上一系列捕食者（不包括蜘蛛）對(duì)稻綠蝽（Nezara viridura）的捕食作用：Miller用ELISA能將瘤額大小蠢（Dendroctonus  frontalis）從許多甲蟲中區(qū)別出來(lái)，并指出了該方法在捕食者-獵物關(guān)系研究中的潛在應(yīng)用價(jià)值。目前，用ELISA研究捕食作用zui有成效的應(yīng)數(shù)Sunderland等人的工作。他們對(duì)麥蚜的廣食性捕食者的捕食作用進(jìn)行了廣泛而深入的研究。在野外與實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上，總結(jié)和改進(jìn)了捕食作用的定量評(píng)價(jià)方法。而國(guó)內(nèi)除黃葵等用ELISA定性研究了枯蟲的捕食性天敵作用評(píng)價(jià)中的研究方法進(jìn)行了總結(jié)，并結(jié)合研究結(jié)果分析了ELISA的應(yīng)用價(jià)值，指出了有待進(jìn)一步研究的問(wèn)題。

方法

（1） 抗原的聶取  任何血清學(xué)試驗(yàn)都依賴于具有價(jià)、特異性強(qiáng)的抗血清的產(chǎn)生，而抗血清的制備離不開抗原的收集、保存和提取。采回的害蟲饑餓24h后，將等體積的磷酸緩沖液（PBS）滴入備用的害蟲中，研磨后加入過(guò)量的PBS（PH=7.4）,在4℃下攪拌24h,然后以4000-5000r/min的速度離心20h,分離上清液。沉渣用上法重復(fù)抽提一次。

將兩次所得的上清液混合后，置于4℃下更換多次冷鹽水透析24h或48h。透析液用冰凍干燥法或反透析法進(jìn)行濃縮。濃縮液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)含量，得到適當(dāng)濃度的蛋白質(zhì)溶液即位抗原。

  抽提過(guò)程中應(yīng)注意：①所有的處理都需在低溫（4℃）下進(jìn)行，以防蛋白質(zhì)變性：②若抗原溶液需保存較長(zhǎng)的時(shí)間，則需加防腐劑（如NaN3）或在凍干狀態(tài)下保存：③為制備特異性強(qiáng)的抗血清，抗原可用標(biāo)準(zhǔn)的生化技術(shù)進(jìn)行純化：④如一次不能收集足夠的抗原，可將每次的蟲體保存在-20℃或?qū)⒖乖瓋龈芍钡椒e累足夠的量。

 （2）抗血清的制備

 ① 所需的抗原量   一般1-10mg/mL。

②免疫途徑   抗原的注射方法有皮下注射、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射、靜脈注射和淋巴結(jié)注射等。其中以靜脈注射zui為簡(jiǎn)單方便，不需要佐劑乳化，產(chǎn)生抗體的高峰值出現(xiàn)較早，一般在一周左右，注射后一周即可采血測(cè)試效價(jià)。免疫過(guò)程中應(yīng)注意：a.佐劑只能現(xiàn)配現(xiàn)用：b.采血時(shí)間不宜拖得太長(zhǎng)。因?yàn)槊庖邥r(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)生交叉反應(yīng)的抗體也越多。

③抗血清的分離   當(dāng)?shù)玫綕M意的效價(jià)時(shí)，即可進(jìn)行取血。將收集到的血液成斜面放置在37℃、溫箱中2h。然后置于4℃冰箱過(guò)夜。次日用滴管吸取抗血清，用離心法（2000-3000r/min,20min）去掉沉淀。然后測(cè)定效價(jià)、鑒定純度。純度用紫外分光光度計(jì)或Folin氏比色法進(jìn)行測(cè)定。抗血清保存于-25℃低溫處。

 ④抗血清的效價(jià)測(cè)定    測(cè)定的方法一般有兩種，即試管沉淀法和免疫雙擴(kuò)散法。對(duì)于免疫酶技術(shù)使用的抗血清，必須具有一定的效價(jià)，試管沉淀法應(yīng)不低于1:2，免疫雙擴(kuò)散法不低于1:2，且要求單價(jià)抗血清。

 （3）捕食者的收集和準(zhǔn)備     主要方法有3個(gè)：①將胃內(nèi)含物擠在質(zhì)量好的濾紙上，但蛋白質(zhì)易與纖維素結(jié)合，若保存過(guò)久則難以洗脫：②將待檢查的捕食封閉在明膠膠囊內(nèi)，并加干燥劑，以使蟲體與膠囊分離：③盡可能快地將采集到的捕食者儲(chǔ)存于低溫下（如-40℃）。前兩種方法適于郵寄和長(zhǎng)途運(yùn)輸，后一種方法能保存較長(zhǎng)的時(shí)間。所有的方法都需保持干燥。對(duì)較大的捕食者，可將消化道分離，像蟻、蝸牛以及蜘蛛等小型動(dòng)物則整個(gè)蟲體。（4）酶聯(lián)抗體的制備  按戊二醛簡(jiǎn)易法進(jìn)行。

  （5）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

       ①直接法    該方法直接利用抗原 與酶聯(lián)抗體的結(jié)合，較簡(jiǎn)單易行。A.假抗原。在聚苯乙烯酶標(biāo)版的孔穴中加入待檢測(cè)的抗原（捕食者胃內(nèi)含物抽提液）0.2mL，在4℃冰箱中過(guò)夜，使抗原黏附于塑料孔壁上。B.洗滌兩次，倒置于干毛巾上，使孔穴中的液體盡量流出。c.加酶聯(lián)抗體。 各孔穴中加入酶聯(lián)抗體0.2mL，在mL37℃下孵育3h，使其充分結(jié)合。d. 加底物。 用PBS充分洗滌以除去未結(jié)合的酶聯(lián)抗體，然后加入底物（鄰苯二胺）0.2 mL，于37℃反應(yīng)30min，用2mol/L硫酸0.05 mL終止反應(yīng)。e. 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定其吸光度值，分別設(shè)陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照，以確定陽(yáng)性反應(yīng)臨界值。

        ②雙抗體夾心法   該方法與直接法的不同在于吸附抗體。a. 包被抗體。酶標(biāo)板的孔穴中加入0.2 mL抗體（用PH=9.6/0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋），置37℃水浴中孵育3h,移入4℃冰箱過(guò)夜。將各孔中多余的抗體傾去，加入PBS洗滌，立即甩去，再將PBS加滿各板孔，置5min,甩去溶液，如此洗滌2次，倒置于干毛巾上，使孔穴中的液體盡量流出。b. 加待檢抗原。沒(méi)孔中加入待檢捕食者胃內(nèi)含物抽提液0.2 mL.同時(shí)設(shè)陽(yáng)性、陰性和空白（PBS）對(duì)照，37℃水溶中孵育3h，轉(zhuǎn)入冰箱中過(guò)夜。如上法洗滌3次。C. 加入酶聯(lián)抗體。每孔加入酶聯(lián)抗體0.2 mL，37℃水浴孵育2h，如上法洗滌3次。d. 加底物。 每孔加入底物鄰苯二胺0.2 mL, 37℃水浴孵育1h,加入2mol/L硫酸0.05，以終止反應(yīng)。e. 用 ELISA檢測(cè)儀測(cè)定其吸光度值。

       ③間接法  與前兩種方法不同點(diǎn)在于酶聯(lián)抗體與抗原的間接結(jié)合。a. 每孔加入待檢抗原0.2 mL ，4℃冰箱中過(guò)夜，使抗原黏附于塑料孔壁上。并依上法洗滌3次。b. 每孔加0.2 mL,用PBS稀釋的抗體，37℃孵育2-3h。c.用PBS洗滌3次后，加入溶于PBS的酶聯(lián)抗體0.2mL，37℃孵育2-3h。d. 加底物，方法同上。e. 用ELISA檢測(cè)

方法評(píng)價(jià)

     ELISA具有許多優(yōu)良特性。盡管有些處理需要*化條件，但只要按要求去做，就十分簡(jiǎn)單明了，并容易掌握。尤其是該方法不需要花費(fèi)大量的時(shí)間作野外觀察，供試所采集的材料可收集起來(lái)并存一段時(shí)間，特別適用于一些只取食汁液而不取食獵物硬殼的捕食者胃內(nèi)含物分析，因?yàn)楂C物的堅(jiān)硬部分沒(méi)有留在捕食者消化道或排泄物內(nèi)。同時(shí)，高靈敏度、特異性、可重復(fù)性以及每次可處理大量材料使得該檢測(cè)法或得了滿意的效果。這是一般的血清學(xué)方法不能比擬的。該方法的一個(gè)缺點(diǎn)是在陰性反應(yīng)中總有一定的顏色產(chǎn)生，必須要有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定陽(yáng)性反應(yīng)的臨界點(diǎn)。

   目前，除繼續(xù)推廣ELISA在捕食作用研究中的應(yīng)用及發(fā)展更為有效的方法外，還有兩個(gè)問(wèn)題需進(jìn)一步研究。一是環(huán)境因子，尤其是溫度對(duì)獵物在捕食者胃內(nèi)殘存時(shí)間的影響，目前的研究還無(wú)法考慮不同溫度下消化速率的差異：二是需要對(duì)實(shí)驗(yàn)室或得的數(shù)據(jù)與田間的進(jìn)行比較分析，并對(duì)陽(yáng)性反應(yīng)率進(jìn)行校正。這些問(wèn)題的研究將有助于定量評(píng)價(jià)捕食作用。

     捕食作用的定量評(píng)價(jià)

   捕食作用的定量評(píng)價(jià)是昆蟲生態(tài)學(xué)家所希望解決的課題之一，但對(duì)生活在自然界的捕食者來(lái)說(shuō)，其捕食作用受到各種環(huán)境因子的影響，它每次的捕食量和捕食后的消化速率是未知的。因此，要對(duì)捕食作用進(jìn)行定量分析就存在很大困難。然而，如果消化的時(shí)間和每次取食的量通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究確定的話，則對(duì)捕食數(shù)量進(jìn)行估計(jì)是可能的。尤其是ELISA的應(yīng)用，為實(shí)現(xiàn)這種可能提供了保證。SOpp等對(duì)已有的工作進(jìn)行了總結(jié)，并提出了一種改進(jìn)的定量評(píng)價(jià)。張文慶等也提出了功能反應(yīng)-血清法來(lái)定量評(píng)價(jià)捕食作用。迄今為止，定量評(píng)價(jià)的公式5能較好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而公式2的擬合效果zui差。但根據(jù)公式要得到準(zhǔn)確的定量評(píng)價(jià)結(jié)果仍是困難的。

     ELISA在捕食作用定量評(píng)價(jià)上的應(yīng)用

     張古忍應(yīng)用ELISA定量評(píng)價(jià)了食蟲溝瘤蛛（Ummeliata insecticeps）對(duì)稻飛虱的捕食作用。將ELISA檢測(cè)的A值轉(zhuǎn)化為捕食量，采用公式5便能計(jì)算出食蟲溝瘤蛛種群對(duì)稻飛虱的捕食總量，但設(shè)定消化系數(shù)（f）為1.其中Qo可通過(guò)以下方法求得：每一個(gè)表現(xiàn)為陽(yáng)性反應(yīng)的捕食性天敵都有一對(duì)應(yīng)的A值，假定捕食作用剛剛完成，消化道內(nèi)的蛋白質(zhì)尚未消化，那么剛剛捕食一頭獵物所測(cè)出的A值就代表了一頭獵物用此A值與標(biāo)本檢測(cè)所得的A值比較，就可以確定天敵捕食害蟲的頭數(shù)，即Qo值。如食蟲溝瘤蛛取食1頭白背飛虱或褐飛虱的高齡幼蟲時(shí)，其A值為0.13或0.14.以1993年5月18日的檢測(cè)結(jié)果為例，食蟲溝瘤蛛對(duì)白背飛虱和褐飛虱檢測(cè)的A值分別為0.14,0,0,0.0.09,0,0和0,0,0.23,0,0,0.在白背飛虱的檢測(cè)中，0.14大于0.13代表捕食了2頭白背飛虱：0.09代表捕食了1頭：褐飛虱檢測(cè)中，0.23代表捕食了2頭。二者相加代表了每頭捕食者當(dāng)天的捕食量，即Qo值。tDP可由實(shí)驗(yàn)測(cè)出。根據(jù)ELISA檢測(cè)結(jié)果，得出的食蟲溝瘤蛛在1993年早稻群落中的捕食量。結(jié)果表明食蟲溝瘤蛛在早稻群落早期對(duì)飛虱的控制作用大于中、后期。

   這種評(píng)價(jià)方法仍是自然捕食活動(dòng)的一種估計(jì)。在不同條件下不同個(gè)體的捕食者其捕食效應(yīng)有差別，不同個(gè)體在不同條件下的消化速率也不一樣，還有重捕食作用等。因此，如何通過(guò)血清學(xué)結(jié)果更準(zhǔn)確地反映捕食者的作用有待于進(jìn)一步研究。

    ELISA分析儀器

    ELISA試劑技術(shù)20世紀(jì)80年代引入中國(guó)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用。與之相關(guān)的分析儀器也得到了快速發(fā)展，我國(guó)先后出現(xiàn)了十余家酶標(biāo)儀、洗板機(jī)生產(chǎn)廠商，在中國(guó)市場(chǎng)上與眾多的進(jìn)口酶標(biāo)儀器進(jìn)行緊張競(jìng)爭(zhēng)。下面分三個(gè)方面對(duì)ELISA中有關(guān)儀器及其在中國(guó)的應(yīng)用作一簡(jiǎn)要介紹。

      分離式酶聯(lián)免疫儀器

    分離式酶聯(lián)免疫儀器主要有酶標(biāo)儀、洗板機(jī)。在血清離心之后，經(jīng)過(guò)加樣、洗板、孵育等過(guò)程，zui后通過(guò)吸光度判定結(jié)果。ELISA實(shí)驗(yàn)在國(guó)內(nèi)主要用于定性檢驗(yàn)，故目前的分離式儀器基本上可以滿足。

    酶標(biāo)儀本質(zhì)上是一臺(tái)于微孔板的、可見(jiàn)光范圍的光電比色計(jì)。在ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)儀是測(cè)定各微孔中試樣的吸光度的關(guān)鍵儀器，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的判定有直接影響，是實(shí)驗(yàn)室*的重要儀器之一。隨著ELISA技術(shù)的普及，酶標(biāo)儀得到了很大發(fā)展，產(chǎn)品種類齊全，型號(hào)多樣，各有特色。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上銷售的酶標(biāo)儀已*擺脫原來(lái)的單孔測(cè)量方式，整板測(cè)量、定性定量計(jì)算、存儲(chǔ)、多種報(bào)告格式、濾光片自動(dòng)轉(zhuǎn)換等已成為基本的、*的功能，各種新推出的酶標(biāo)儀性能日益完善，功能不斷擴(kuò)充。具體有：

（1）       測(cè)量高速化  從目前不斷推出的酶標(biāo)儀趨勢(shì)來(lái)看，整板測(cè)量速度均在10s以內(nèi)，這有利于防止測(cè)量過(guò)程中各微孔吸光度的微小變化，盡可能克服環(huán)境對(duì)結(jié)果的影響，同時(shí)可以滿足動(dòng)力測(cè)量的要求，測(cè)量速度在20s以上的儀器將處于不利于地位。我國(guó)現(xiàn)生產(chǎn)的酶標(biāo)儀，測(cè)量整板速度一般為25s,產(chǎn)品更新周期較長(zhǎng)。

（2）       寬吸光度范圍   盡管酶標(biāo)儀A=0-2.5的吸光度范圍*可以滿足實(shí)驗(yàn)的要求，但國(guó)外新推出的儀器都擴(kuò)寬了早期型號(hào)的吸光度范圍，較的酶標(biāo)儀其線性范圍可以達(dá)到A=4.0，并且保持很好的精密度，如BIORAD公司的Benchmark,在400-750nm、A=0-4.0時(shí)其重復(fù)性與線性均不大于3.5%。又如LABYSTEMS公司的Multi-skan Ascent,其吸光度讀數(shù)范圍達(dá)A=0-4.0，在A=3.0-4.0范圍，其線性不超過(guò)2%, RSD小于1.0%。

（3）       擴(kuò)展到紫外  增加紫外濾光片幾乎是廠商的共同選擇。由于各種酶標(biāo)儀都配有放置濾光片的可自動(dòng)轉(zhuǎn)換的機(jī)構(gòu)，可以同時(shí)安裝6-8片濾光片，擴(kuò)展紫外功能相對(duì)容易，一般都增加340nm濾光片。

（4）       具有孵育功能  可以自動(dòng)、控制反應(yīng)溫度，使微孔板的孵育過(guò)程在儀器內(nèi)部完成，降低外界干擾，簡(jiǎn)化操作步驟。如BIORAD公司的Benchmark,芬蘭LABSYSTEMS公司的Multiskan  Ascent,BIOTCK公司的EIX808等。

（5）       具有動(dòng)力學(xué)檢測(cè)功能   常規(guī)ELISA是一種終點(diǎn)法測(cè)量實(shí)驗(yàn)，測(cè)量前需要加入終止液來(lái)抑制酶免反應(yīng)的進(jìn)行，通過(guò)吸光度的大小來(lái)計(jì)算待測(cè)物質(zhì)的濃度，動(dòng)力學(xué)方法是通過(guò)測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中吸光度的變化速率來(lái)計(jì)算相應(yīng)的待測(cè)物質(zhì)的含量的，酶標(biāo)儀的測(cè)量速度加快后，只要增加相應(yīng)的軟件，就可以使用酶標(biāo)儀完成某些生化指標(biāo)的動(dòng)力學(xué)測(cè)量。

洗板機(jī)是ELISA試驗(yàn)保證洗滌效果、進(jìn)而保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的重要儀器，洗板機(jī)的作用已不再是簡(jiǎn)單的代替人的手工勞動(dòng)的自動(dòng)化裝置。目前國(guó)內(nèi)的洗板機(jī)除提供常規(guī)的設(shè)備清洗次數(shù)、清洗條數(shù)、浸泡時(shí)間等基本功能之外，還根據(jù)用戶的需要分別增加了底部沖洗、兩點(diǎn)吸液、板式/條式洗板、震蕩、位置調(diào)節(jié)及自動(dòng)清洗管路、自動(dòng)換液存儲(chǔ)多種洗板程序等功能，清洗殘留量由原來(lái)的5-6UL/孔減小到2UL/孔，有的洗板機(jī)允許用戶對(duì)洗板過(guò)程的每一步的流量、時(shí)間、位置等進(jìn)行詳盡的設(shè)定。生產(chǎn)廠商根據(jù)各自對(duì)洗板技術(shù)的研究，努力提高儀器可靠性與自動(dòng)化程度，同時(shí)為用戶提供一個(gè)*的、完善的洗滌環(huán)境。國(guó)內(nèi)洗板機(jī)就洗板效果、產(chǎn)品可靠性等主要指標(biāo)已達(dá)到進(jìn)口以前的水平，與進(jìn)口儀器相比，其價(jià)格、售后服務(wù)占一定優(yōu)勢(shì)，主要差距是無(wú)定量加液。

組合式的酶聯(lián)免疫儀器

 組合式的酶聯(lián)免疫儀器分三類：全自動(dòng)酶聯(lián)免疫系統(tǒng)、自動(dòng)樣品處理系統(tǒng)、流水線作業(yè)式組合系統(tǒng)。前兩者主要用于各大血站、醫(yī)院，后者主要用于試劑生產(chǎn)廠商。

全自動(dòng)酶聯(lián)免疫系統(tǒng)是將ELISA試驗(yàn)中的各個(gè)步驟，從加樣、孵育、洗滌、震蕩、閉塞到定性或定量分析、報(bào)告存儲(chǔ)與打印功能全部集成在一臺(tái)儀器中，由儀器按用戶事先設(shè)計(jì)的程序自動(dòng)進(jìn)行。HAMILTON公司的FAME（世界上*臺(tái)自動(dòng)板式ELISA系統(tǒng)）、BIORAD公司的CAA、奧斯邦公司的AMP、TECAN公司的Minilyser、ORGANO公司的TEKTIME、意大利S.P.A. DIVISION  STRUMENTI的PersonaiLAB等全自動(dòng)酶聯(lián)免疫系統(tǒng)已先后進(jìn)入國(guó)內(nèi)市場(chǎng)。近兩年新進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)還有DYNDRX、公司的DSX、 阿克蘇公司的Flextk2、BIOASIA代理的TRITURUS等。全自動(dòng)酶聯(lián)免疫系統(tǒng)的出現(xiàn)滿足了各大醫(yī)院、血站大批量重復(fù)檢驗(yàn)的要求，提高了這些單位的檢查檢驗(yàn)效率與實(shí)驗(yàn)水平，有效控制了大批量檢驗(yàn)中極有可能出現(xiàn)的人工操作失誤，有利于ELISA實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量保證與提高，其國(guó)內(nèi)市場(chǎng)穩(wěn)步增長(zhǎng)。

自動(dòng)樣品處理系統(tǒng)主要用于完成ELISA實(shí)驗(yàn)中的繁瑣無(wú)味、人工容易出錯(cuò)的加樣、稀釋滴定、孵育、洗滌等步驟，完成之后再由酶標(biāo)儀判定結(jié)果。使用自動(dòng)樣品處理系統(tǒng)利用原有的酶標(biāo)儀，既節(jié)約資金，又實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)過(guò)程的自動(dòng)化，是一種很經(jīng)濟(jì)的方案。TECAN公司推出了面向中國(guó)血站的MINITRED自動(dòng)樣品系統(tǒng)，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上常見(jiàn)的HYPERI-ON公司的HYPREPTTLUS、DYNEX公司的UItra等。